Auteur Sujet: Préparation chimique de bactéries à Gram négatifs  (Lu 4510 fois)

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Préparation chimique de bactéries à Gram négatifs
« le: mars 23, 2014, 05:42:54 pm »
21-11-2006
Bonjour,
je suis à la recherche de protocoles spécifiquement adaptés à la préparation chimique de bactéries à Gram négatifs, ceci afin de préserver leur forme et d'éviter un écrasement quasi systématique des structures. Merci de vos réponses et ou solutions.
Thierry MEYLHEUC
INRA, Jouy-en-Josas

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Re : Préparation chimique de bactéries à Gram négatifs
« Réponse #1 le: mars 23, 2014, 05:43:35 pm »
Pour éviter l'effondrement il faut fixer les bactéries avec le mélange suivant :
Glutaraldéhyde à 2% dans un tampon phosphate ou cacodylate de Na à 0,1M pH 7,3 pendant minimum 2 heures (voir plus). (le tampon peut être le tampon de culture sans indicateur coloré et sans apport de protéines ou sucres, il doit avoir le même pH que celui de culture).
Puis rincer plusieurs fois avec le tampon à 0,175M pH 7,3
Déshydrater avec de l'alcool éthylique puis dans de l' hexaméthyldisilazane (= HMDS) (Merck) selon la procédure suivante :
Après le dernier bain de rinçage faire
   - un bain alcool éthylique à 30% dans l'eau distillée, 10 minutes minimum
   - un bain alcool éthylique à 50% dans l'eau distillée, 10 minutes minimum
   - un bain alcool éthylique à 80% dans l'eau distillée, 10 minutes minimum
   - deux bains alcool éthylique à 100% de 10 minutes
   - puis un bain de 15 minutes dans un mélange 1/2 HMDS + 1/2 alcool éthylique 100%
   - deux bains de 15 minutes dans l' HMDS pur pour finir.
Ces bains peuvent être prolongés si le résultat n'est pas satisfaisant.
Un dernier bain dans l'HMDS pur est laissé sous la hotte pour évaporation complète.
Pour faciliter les passages dans les différents bains les bactéries sont déposées sur un filtre Nuclépore en polycarbonate de porosité 1µ. Ce filtre est très lisse sur une de ses surfaces (la face brillante) ce qui assure une bonne observation des bactéries. Il faut que la suspension de départ soit assez riche en bactéries, que celles-ci soit bien dispersées dans la solution et que la solution est un minimum de résidus de culture pouvant créer un dépôt sur le filtre. Si les bactéries sont cultivées en milieu liquide il est souvent nécessaire d'éliminer le plus possible celui ci par décantation et remise en suspension dans un tampon (à 0,175M pH 7,3) avant le dépôt sur le filtre
(Réponse de Jacqueline Boumendil - courriel : jboumendil@tiscali.fr)